Qu'est-ce qui sous-tend l'hybridation de l'ADN ? Bien que la séquence d'ADN double brin soit généralement stable dans des conditions physiologiques, la modification de ces conditions en laboratoire (généralement en augmentant la température ambiante) entraînera la séparation des molécules en brins individuels. Ces dernières sont complémentaires les unes des autres, mais peuvent également compléter d'autres séquences présentes dans leur environnement. L'abaissement de la température ambiante permet aux molécules simple brin de s'hybrider ou de "s'hybrider" les unes avec les autres. C'est la méthode d'hybridation de l'ADN.
Le concept du point de vue de la biologie moléculaire
Les scientifiques impliqués à la fois dans la réplication de l'ADN et dans la transcription de l'ADN en ARN s'appuient sur les croisements de nucléotides et les techniques de biologie moléculaire. Cela comprend les transferts Southern et Northern, la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et la plupart des approches d'hybridation et de séquençage ADN-ARN.
Demande
L'hybridation est la propriété principale des nucléotidesséquences et est utilisé dans de nombreuses méthodes de biologie moléculaire. La relation génétique globale de deux espèces peut être déterminée en hybridant des segments de leur ADN (hybridation ADN-ADN). En raison des similitudes de séquence entre des organismes étroitement apparentés, une température plus élevée est nécessaire pour faire fondre ces hybrides d'ADN par rapport à des organismes plus éloignés. Diverses méthodes utilisent l'hybridation pour déterminer l'origine d'un échantillon d'ADN, y compris la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Dans un autre procédé, de courtes séquences d'ADN sont hybridées à l'ARNm cellulaire pour identifier les gènes exprimés. Les sociétés pharmaceutiques explorent l'utilisation de l'ARN antisens pour se lier à l'ARNm indésirable, empêchant le ribosome de traduire l'ARNm en protéine.
L'hybridation ADN-ADN fait généralement référence à une technique de biologie moléculaire qui mesure le degré de similitude génétique entre des pools de séquences d'ADN. Il est couramment utilisé pour déterminer la distance génétique entre deux organismes. Il a été largement utilisé en phylogénie et en taxonomie.
Méthodologie
L'ADN d'un organisme a été marqué, puis mélangé avec de l'ADN non marqué qui pouvait lui être comparé. Le mélange est incubé pour permettre aux brins d'ADN de se dissocier puis de refroidir pour former un ADN double brin hybride régénéré. Les séquences hybrides avec un degré élevé de similarité se lieront plus étroitement et nécessiteront plus d'énergie pour les séparer: c'est-à-dire qu'elles se séparent lorsqu'elles sont chauffées à une température plus élevée.température que les séquences dissemblables, un processus connu sous le nom de "fusion de l'ADN".
fusion de l'ADN
En évaluant le profil de fusion de l'ADN hybride, l'ADN double brin est lié à une "colonne" et le mélange résultant est chauffé. A chaque étape, la colonne est lavée et les séquences d'ADN qui fondent deviennent simple brin et lavent la colonne. Les températures auxquelles l'ADN marqué sort de la colonne reflètent la quantité de similarité entre les séquences (et le modèle d'auto-pliage sert de contrôle). Ces résultats sont combinés pour déterminer le degré de similitude génétique entre les organismes. Selon la microbiologie moderne, l'hybridation de l'ADN est impossible sans comprendre ces choses.
Lorsque plusieurs espèces d'acides ribonucléiques (ou désoxyribonucléiques) sont comparées de cette manière, les valeurs de similarité permettent de placer les espèces dans l'arbre phylogénétique. C'est donc l'une des approches possibles pour mener une systématique moléculaire. Charles Sibley et John Ahlquist, les pionniers de cette technique, ont utilisé l'hybridation ADN-ADN pour étudier les relations phylogénétiques des oiseaux (taxonomie Sibley-Ahlquist) et des primates.
Importance pour la biologie
L'hybridation ADN-ADN est l'étalon-or pour distinguer les espèces bactériennes, avec une valeur de similarité de plus de 70 %, indiquant que les souches comparées appartiennent à des espèces différentes. En 2014, un seuil de 79 % de similarité a été proposé pour séparer une sous-espèce bactérienne.
Les critiques soutiennent que la technique est inexacte pour comparer des espèces étroitement apparentées, car toute tentative de mesurer les différences entre les séquences orthologues entre les organismes est submergée par l'hybridation des homologues paralogues dans le génome d'un organisme. Le séquençage de l'ADN et les comparaisons de séquences computationnelles sont actuellement la méthode couramment utilisée pour déterminer la distance génétique, bien que cette approche soit toujours utilisée en microbiologie pour aider à identifier les bactéries.
La méthode actuelle consiste à effectuer une hybridation ADN-ADN dans du silicone en utilisant des génomes entièrement ou partiellement séquencés. Le GGDC développé par le DSMZ est l'outil connu le plus précis pour calculer les valeurs de type DDH. Entre autres améliorations algorithmiques, il résout le problème des séquences paralogues en les filtrant soigneusement hors des correspondances entre deux séquences du génome.
Méthode FISH
L'hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une technique de laboratoire utilisée pour détecter et séquencer l'ADN, souvent sur un chromosome spécifique.
En 1969, Joseph Gall et Mary Lou Pardu ont publié un article démontrant que des copies radioactives d'une séquence d'ADN ribosomique pouvaient être utilisées pour détecter des séquences d'ADN complémentaires dans le noyau d'un œuf de grenouille. Depuis ces observations originales, de nombreux raffinements ont augmenté la polyvalence etla sensibilité de la procédure à tel point que l'hybridation in situ ("in place", latin) est désormais considérée comme un outil important en cytogénétique. (Le terme in situ est désormais également utilisé pour désigner le stade initial de la croissance du carcinome, lorsque seul le tissu épithélial est impliqué dans le processus pathologique.)
Séquence d'hybridation fluorescente
Les sondes d'ARN peuvent être conçues pour n'importe quel gène ou n'importe quelle séquence au sein d'un gène afin de visualiser l'ARNlnc et l'ARNm de miARN dans les tissus et les cellules. FISH est utilisé en étudiant le cycle de reproduction cellulaire, en particulier l'interphase nucléaire pour d'éventuelles anomalies chromosomiques. FISH vous permet d'analyser une grande série de cas d'archives, il est beaucoup plus facile d'identifier le chromosome identifié en créant une sonde avec une base chromosomique artificielle qui attirera des chromosomes similaires.
Signaux d'hybridation pour chaque sonde lorsqu'une anomalie nucléaire est détectée: chaque sonde de détection d'ARNm et d'ARNlnc est constituée de 20 paires d'oligonucléotides, chaque paire couvre un espace de 40-50 pb. p. Les sondes utilisent une chimie exclusive pour détecter l'ARNm.
Hybridation avec des sondes ADN
Les sondes sont souvent fabriquées à partir de fragments d'ADN qui ont été isolés, purifiés et amplifiés pour être utilisés dans la conception du génome humain. La taille du génome humain est si grande par rapport à la longueur qui peut être directement séquencée qu'il est nécessaire de le diviser enfragments. En fin de compte, ces fragments ont été ordonnés en digérant une copie de chaque fragment en unités encore plus petites à l'aide d'endonucléases spécifiques à la séquence pour mesurer la taille de chaque petit fragment à l'aide de la chromatographie d'exclusion de taille en utilisant ces informations pour déterminer où les grands fragments se chevauchaient.
Pour préserver les éléments avec leurs séquences d'ADN individuelles, les fragments ont été ajoutés à un système de populations bactériennes qui se répètent sans cesse. Des populations clonales de bactéries, chaque population conservant un seul chromosome artificiel, sont stockées dans divers laboratoires à travers le monde. Les chromosomes artificiels (BAC) peuvent être cultivés, extraits et marqués dans n'importe quel laboratoire disposant d'une bibliothèque. Les bibliothèques génomiques portent souvent le nom des institutions où elles ont été développées. Un exemple est la bibliothèque RPCI-11, du nom du Roswell Cancer Institute de Buffalo (New York, USA). Ces fragments représentent environ 100 000 paires de bases et sont à la base de la plupart des sondes FISH.
