Les méthodes de recherche en biologie moléculaire jouent un rôle important dans la médecine moderne, la médecine légale et la biologie. Grâce aux progrès de l'étude de l'ADN et de l'ARN, une personne est capable d'étudier le génome d'un organisme, de déterminer l'agent causal d'une maladie, de reconnaître l'acide nucléique souhaité dans un mélange d'acides, etc.
Méthodes de recherche en biologie moléculaire. Qu'est-ce que c'est ?
Dans les années 70 et 80, les scientifiques ont pour la première fois réussi à déchiffrer le génome humain. Cet événement a donné une impulsion au développement du génie génétique et de la biologie moléculaire. L'étude des propriétés de l'ADN et de l'ARN a conduit au fait qu'il est désormais possible d'utiliser ces acides nucléiques pour diagnostiquer une maladie, étudier les gènes.
Obtenir de l'ADN et de l'ARN
Les méthodes de diagnostic biologique moléculaire nécessitent la présence de matériel de départ: il s'agit le plus souvent d'acides nucléiques. Il existe plusieurs façons d'isoler ces substances des cellules d'organismes vivants. Chacun d'eux a ses propres avantages et inconvénients, et il est nécessaireprendre en compte lors du choix d'une méthode d'isolement d'acides nucléiques purs.
1. Obtention d'ADN selon Marmur. La méthode consiste à traiter un mélange de substances avec de l'alcool, à la suite de quoi l'ADN pur précipite. L'inconvénient de cette méthode est l'utilisation de substances agressives: phénol et chloroforme.
2. Isolement de l'ADN selon Boom. La principale substance utilisée ici est le thiocyanate de guanidine (GuSCN). Il contribue à la précipitation de l'acide désoxyribonucléique sur des substrats spécialisés, à partir desquels il peut ensuite être collecté à l'aide d'un tampon spécial. Cependant, GuSCN est un inhibiteur de PTC, et même une petite partie de celui-ci qui pénètre dans l'ADN précipité peut affecter le cours de la réaction en chaîne de la polymérase, qui joue un rôle important dans le travail avec les acides nucléiques.
3. Sédimentation des impuretés. La méthode diffère des précédentes en ce que ce ne sont pas les molécules d'acide désoxyribonucléique qui sont précipitées, mais les impuretés. Pour ce faire, des échangeurs d'ions sont utilisés. L'inconvénient est que toutes les substances ne peuvent pas précipiter.
4. Dépistage de masse. Cette méthode est utilisée dans les cas où des informations exactes sur la composition de la molécule d'ADN ne sont pas nécessaires, mais il est nécessaire d'obtenir des données statistiques. Cela s'explique par le fait que la structure de l'acide nucléique peut être endommagée lorsqu'il est traité avec des détergents, en particulier des alcalis.
Classification des méthodes de recherche
Toutes les méthodes de recherche en biologie moléculaire sont divisées en trois grands groupes:
1. Amplification (utilisant de nombreuses enzymes). Icifait référence à la PCR - réaction en chaîne par polymérase, qui joue un rôle important dans de nombreuses méthodes de diagnostic.
2. Non amplifiant. Ce groupe de procédés est directement lié au fonctionnement des mélanges d'acides nucléiques. Les exemples sont 3 blots, l'hybridation in situ, etc.
3. Méthodes basées sur la reconnaissance d'un signal provenant d'une molécule sonde qui se lie à une sonde ADN ou ARN spécifique. Un exemple est le Hybride Capture System (hc2).
Enzymes utilisables dans les méthodes de recherche en biologie moléculaire
De nombreuses méthodes de diagnostic moléculaire impliquent l'utilisation d'un large éventail d'enzymes. Voici les plus couramment utilisés:
1. Enzyme de restriction - "coupe" la molécule d'ADN en parties nécessaires.
2. ADN polymérase - synthétise une molécule double brin d'acide désoxyribonucléique.
3. Transcriptase inverse (révertase) - utilisée pour synthétiser l'ADN sur une matrice d'ARN.
4. ADN ligase - responsable de la formation de liaisons phosphodiester entre les nucléotides.
5. Exonucléase - élimine les nucléotides des sections terminales de la molécule d'acide désoxyribonucléique.
PCR est la principale méthode d'amplification de l'ADN
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est activement utilisée dans la biologie moléculaire moderne. Il s'agit d'une méthode dans laquelle un grand nombre de copies peuvent être obtenues à partir d'une seule molécule d'ADN (les molécules sont amplifiées).
Fonctions principales du PCR:
- diagnosticmaladies;
- clonage de segments d'ADN, de gènes.
Les éléments suivants sont nécessaires pour réaliser une réaction en chaîne par polymérase: la molécule d'ADN initiale, une ADN polymérase thermostable (Taq ou Pfu), des désoxyribonucléotides phosphates (sources de bases azotées), des amorces (2 amorces pour 1 molécule d'ADN) et le système tampon lui-même, dans lequel toutes les réactions sont possibles.
PCR se compose de trois étapes: dénaturation, hybridation d'amorce et élongation.
1. Dénaturation. À une température de 94 à 95 degrés Celsius, les liaisons hydrogène entre les deux brins d'ADN sont rompues et nous obtenons ainsi deux molécules à un seul brin.
2. Recuit d'amorce. À une température de 50 à 60 degrés Celsius, les amorces sont attachées aux extrémités des molécules d'acide nucléique simple brin par le type de complémentarité.
3. Élongation. À une température de 72 degrés, la synthèse de molécules filles double brin d'acide désoxyribonucléique se produit.
Séquençage ADN
Les méthodes de recherche en biologie moléculaire nécessitent souvent la connaissance de la séquence nucléotidique d'une molécule d'acide désoxyribonucléique. Un séquençage est effectué pour déterminer le code génétique. Les diagnostics moléculaires du futur seront basés sur les connaissances acquises grâce au séquençage humain.
On distingue les types de séquencement suivants:
- Séquençage Maxam-Gilbert;
- Séquencement Sanger;
- pyroséquençage;
- nanoporeséquençage.
