L'absorption et la réémission ultérieure de la lumière par les milieux inorganiques et organiques sont le résultat de la phosphorescence ou de la fluorescence. La différence entre les phénomènes est la longueur de l'intervalle entre l'absorption de la lumière et l'émission du flux. Avec la fluorescence, ces processus se produisent presque simultanément, et avec la phosphorescence, avec un certain retard.
Contexte historique
En 1852, le scientifique britannique Stokes décrit pour la première fois la fluorescence. Il a inventé le nouveau terme à la suite de ses expériences avec le spath fluor, qui émettait de la lumière rouge lorsqu'il était exposé à la lumière ultraviolette. Stokes a noté un phénomène intéressant. Il a découvert que la longueur d'onde de la lumière fluorescente est toujours plus longue que celle de la lumière d'excitation.
De nombreuses expériences ont été menées au 19ème siècle pour confirmer l'hypothèse. Ils ont montré qu'une variété d'échantillons deviennent fluorescents lorsqu'ils sont exposés à la lumière ultraviolette. Les matériaux comprenaient, entre autres, des cristaux, des résines, des minéraux, de la chlorophylle,matières premières médicinales, composés inorganiques, vitamines, huiles. L'utilisation directe de colorants pour l'analyse biologique n'a commencé qu'en 1930
Description de la microscopie à fluorescence
Certains des matériaux utilisés dans la recherche dans la première moitié du XXe siècle étaient très spécifiques. Grâce à des indicateurs qui ne pouvaient pas être obtenus par des méthodes de contraste, la méthode de microscopie à fluorescence est devenue un outil important dans la recherche biomédicale et biologique. Les résultats obtenus étaient d'une importance non négligeable pour la science des matériaux.
Quels sont les avantages de la microscopie à fluorescence ? Grâce à de nouveaux matériaux, il est devenu possible d'isoler des cellules hautement spécifiques et des composants submicroscopiques. Un microscope à fluorescence vous permet de détecter des molécules individuelles. Une variété de colorants vous permet d'identifier plusieurs éléments en même temps. Bien que la résolution spatiale de l'équipement soit limitée par la limite de diffraction, qui, à son tour, dépend des propriétés spécifiques de l'échantillon, la détection de molécules en dessous de ce niveau est également tout à fait possible. Divers échantillons présentent une autofluorescence après irradiation. Ce phénomène est largement utilisé dans la pétrologie, la botanique, l'industrie des semi-conducteurs.
Caractéristiques
L'étude des tissus animaux ou des micro-organismes pathogènes est souvent compliquée par une autofluorescence non spécifique trop faible ou très forte. Cependant, la valeur enla recherche acquiert l'introduction dans le matériau de composants excités à une longueur d'onde spécifique et émettant un flux lumineux d'intensité requise. Les fluorochromes agissent comme des colorants capables de s'auto-attacher aux structures (invisibles ou visibles). En même temps, ils se distinguent par une grande sélectivité vis-à-vis des cibles et du rendement quantique.
La microscopie à fluorescence est devenue largement utilisée avec l'avènement des colorants naturels et synthétiques. Ils avaient des profils d'émission et d'intensité d'excitation spécifiques et visaient des cibles biologiques spécifiques.
Identification de molécules individuelles
Souvent, dans des conditions idéales, vous pouvez enregistrer la lueur d'un seul élément. Pour ce faire, il est nécessaire, entre autres, d'assurer un bruit de détecteur et un bruit de fond optique suffisamment faibles. Une molécule de fluorescéine peut émettre jusqu'à 300 000 photons avant d'être détruite par le photoblanchiment. Avec un taux de collecte de 20 % et une efficacité de processus, ils peuvent être enregistrés pour un montant d'environ 60 000
La microscopie à fluorescence, basée sur des photodiodes à avalanche ou la multiplication d'électrons, a permis aux chercheurs d'observer le comportement de molécules individuelles pendant quelques secondes, voire quelques minutes.
Difficultés
Le problème clé est la suppression du bruit de fond optique. En raison du fait que de nombreux matériaux utilisés dans la construction de filtres et de lentilles présentent une certaine autofluorescence, les efforts des scientifiques dans les premières étapes se sont concentrés sur la délivrancecomposants à faible fluorescence. Cependant, des expériences ultérieures ont conduit à de nouvelles conclusions. En particulier, la microscopie à fluorescence basée sur la réflexion interne totale permet d'obtenir un faible bruit de fond et un flux lumineux d'excitation élevé.
Mécanisme
Les principes de la microscopie à fluorescence basée sur la réflexion interne totale consistent à utiliser une onde à décroissance rapide ou qui ne se propage pas. Il apparaît à l'interface entre des milieux d'indices de réfraction différents. Dans ce cas, le faisceau lumineux traverse un prisme. Il a un indice de réfraction élevé.
Le prisme est adjacent à une solution aqueuse ou à un verre à faible paramètre. Si le faisceau de lumière est dirigé vers lui à un angle supérieur à l'angle critique, le faisceau est complètement réfléchi par l'interface. Ce phénomène, à son tour, donne naissance à une onde non propagée. En d'autres termes, un champ électromagnétique est généré qui pénètre dans un milieu avec un indice de réfraction inférieur à une distance inférieure à 200 nanomètres.
Dans une onde non propagative, l'intensité lumineuse sera tout à fait suffisante pour exciter les fluorophores. Cependant, en raison de sa profondeur exceptionnellement faible, son volume sera très faible. Le résultat est un arrière-plan de bas niveau.
Modification
La microscopie à fluorescence basée sur la réflexion interne totale peut être réalisée avec l'épi-illumination. Cela nécessite des objectifs avec une ouverture numérique accrue (au moins 1,4, mais il est souhaitable qu'elle atteigne 1,45-1,6), ainsi qu'un champ partiellement éclairé de l'appareil. Ce dernier est réalisé avec une petite tache. Pour une plus grande uniformité, un anneau mince est utilisé, à travers lequel une partie du flux est bloquée. Pour obtenir un angle critique après lequel la réflexion totale se produit, un niveau élevé de réfraction du milieu d'immersion dans les lentilles et le verre de protection du microscope est nécessaire.
