La coloration de Gram est largement utilisée en microbiologie car c'est l'un des moyens les plus simples de différencier les bactéries en fonction de la composition de leur paroi cellulaire. Selon Gram, toutes les bactéries peuvent être divisées en gram-positives (Gram (+)) et gram-négatives (Gram (-)). La méthode de coloration de Gram a été développée en 1884 et n'a pas perdu de sa popularité depuis lors, bien qu'elle ait été modifiée à plusieurs reprises.
Structure de la paroi cellulaire
La coloration de Gram révèle si une bactérie est Gram-positive ou Gram-négative. La division des bactéries en Gram (+) et Gram (-) s'effectue en fonction de la structure de leur paroi cellulaire.
La paroi cellulaire contient la plus grande quantité de peptidoglycane (muréine) - une substance complexe, qui comprend le peptapeptide et le glycane. Le glycane est constitué d'une alternance de résidus de N-acétylglucosamine et d'acide N-acétylmuramique liés entre eux par β-1,Liaisons 4-glycosidiques. Le peptidoglycane assure le maintien de la forme cellulaire, la protection osmotique et les fonctions antigéniques.
Principales différences entre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives
Différentes bactéries ont différentes épaisseurs de couche de peptidoglycane. Chez les bactéries classées comme gram-positives, elle varie de 15 à 80 nm, tandis que chez les gram-négatives, elle est de 2 à 8 nm. Dans le même temps, les bactéries Gram-négatives ont une structure spéciale sous la couche de peptidoglycane, ce que les bactéries Gram-positives n'ont pas - l'espace périplasmique. Cet espace est rempli d'enzymes hydrolytiques - β-lactamase, ribonucléase 1, phosphatase. Ce sont ces enzymes qui sont responsables de la résistance des bactéries Gram-négatives à de nombreux antibiotiques.
La couche de peptidoglycane Gram(-) des bactéries est liée au lipopolysaccharide, une structure antigénique contenant une endotoxine. Dans les bactéries Gram(+), les acides teichoïques remplissent des fonctions similaires.
Les bactéries Gram-négatives ont une structure supplémentaire - la membrane externe.
L'essence de la méthode de coloration
Avant de commencer la coloration, des frottis des bactéries étudiées sont préparés. Pour ce faire, de l'eau est versée goutte à goutte sur une lame de verre et une culture de micro-organismes y est ajoutée avec une boucle bactérienne. Ensuite, une fois l'eau complètement sèche, le frottis est fixé - la lame de verre est portée plusieurs fois sur la flamme du brûleur. La coloration de Gram est plus efficace que la coloration des bactéries vivantes - les molécules de colorant se lient mieux aux cellules mortes.
La coloration se fait en plusieurs étapes:
- De petits morceaux de papier filtre sont placés sur un frottis fixe et le colorant principal est versé - violet de gentiane ou bleu de méthylène.
- Après 3 à 5 minutes, retirez le papier filtre coloré et remplissez le frottis avec la solution de Lugol pendant 1 minute. Dans ce cas, la préparation noircit.
- La solution de Lugol est égouttée et le frottis est traité avec de l'alcool éthylique pur: quelques gouttes sont versées sur la préparation, égouttée après 20 secondes. La procédure est répétée 2-3 fois.
- Rincer la lame de test avec de l'eau distillée.
- Produire une coloration supplémentaire - terminer la préparation avec de la fuchsine. Après 1-2 minutes, le colorant est lavé.
- Une fois l'eau sèche, examinez le frottis au microscope. Les bactéries Gram-positives seront bleu-violet, les bactéries Gram-négatives seront roses ou rouges.
Causes des différents motifs de coloration
Comme décrit ci-dessus, la coloration de Gram des bactéries colore les bactéries Gram-positives en bleu-violet, tandis que les bactéries Gram-négatives se colorent en rouge ou en rose. La raison de la coloration différentielle des bactéries par cette méthode est qu'après que la forme soluble du violet de gentiane pénètre dans la cellule, le colorant passe dans la forme iodée insoluble. Lors du traitement des bactéries à l'alcool éthylique, les lipides sont extraits de la membrane sous l'action de ce solvant non polaire. La membrane devient alors poreuse et ne constitue plus une barrière significative au lessivage des colorants. Cependantle peptidoglycane est plus résistant aux solvants non polaires, y compris l'alcool. C'est lui qui empêche le lessivage du colorant, de sorte que les bactéries avec une épaisse couche de muréine deviennent bleu-violet (gram-positives) et après un traitement à l'alcool, elles ne changent pas de couleur.
La fine couche de murein de bactéries gram-négatives ne peut pas retenir les molécules de colorant dans la cellule, donc après l'action de l'alcool, elles deviennent incolores - tache gram-négatif.
Après exposition d'un frottis à la fuchsine, les bactéries colorées à Gram restent bleu-violet, tandis que les bactéries Gram-négatives deviennent rose-rouge.
Exemples de bactéries Gram(+) et Gram(-)
Les bactéries Gram-négatives comprennent les cyanobactéries, les bactéries soufrées, les bactéries ferreuses, les chlamydia, les rickettsies, les bactéries acétiques, de nombreuses méthylobactéries, les bactéries thioniques, les arsenitobactéries, les carboxybactéries.
Les bifidobactéries, de nombreuses bactéries aquatiques, les streptocoques et les staphylocoques sont à Gram positif.
