Lors de l'étude des substances en chimie organique, plus d'une douzaine de réactions qualitatives différentes sont utilisées pour déterminer la teneur de certains composés. Une telle analyse visuelle vous permet de comprendre immédiatement si les substances nécessaires sont présentes, et si elles ne sont pas présentes, vous pouvez réduire considérablement les expériences supplémentaires pour les identifier. Ces réactions incluent la ninhydrine, qui est la principale dans la détermination visuelle des composés aminés.
Qu'est-ce que c'est ?
La ninhydrine est un composé dicarbonyle contenant un cycle aromatique auquel est attaché un hétérocycle, dont le second atome a 2 groupes hydroxyle (OH-). Cette substance est obtenue par oxydation directe de l'inandione - 1, 3, et, par conséquent, selon la nomenclature internationale, elle porte le nom suivant: 2, 2 - dihydroxyinandione -1, 3 (Fig. 1).
La ninhydrine pure est un cristal jaune ou blancdes couleurs qui, lorsqu'elles sont chauffées, se dissolvent bien dans l'eau et d'autres solvants organiques polaires, comme l'acétone. C'est une substance plutôt nocive, si elle entre en contact avec la peau en grande quantité ou les muqueuses, elle provoque des irritations, y compris en cas d'inhalation. Travailler avec ce composé doit être prudent et uniquement avec des gants, car lorsqu'il entre en contact avec la peau, il réagit avec les protéines des cellules cutanées et le colore en violet.
Substances réactives
Comme mentionné ci-dessus, la réaction à la ninhydrine est principalement utilisée pour la détermination visuelle de la teneur en composés aminés:
- acides α-aminés (y compris dans les protéines);
- sucres aminés;
- alcaloïdes contenant les groupes –NH2 et -NH;
- diverses amines.
Il convient de noter que les amines secondaires et tertiaires réagissent parfois très faiblement, des recherches supplémentaires sont donc nécessaires pour confirmer leur présence.
Diverses méthodes de chromatographie sont utilisées pour la détermination quantitative, par exemple la chromatographie sur papier (BC), la chromatographie sur couche mince (TLC) ou le lavage de supports solides avec une solution de ninhydrine dans divers milieux.
Cette réaction n'est pas spécifique aux composés aminés, car le réactif peut y entrer avec tous à la fois. Cependant, de la part des produits de réaction, il a une particularité sous la forme de la libération de bulles de dioxyde de carbone (CO2), et ceci n'est typique que lors de l'interaction avec l'α-amino acides.
Caractéristiques du mécanisme
BIl existe différentes interprétations de l'équation de réaction à la ninhydrine dans la littérature. Certains chercheurs omettent la formation d'hydrindanthine à partir de la 2-aminoinandione, qui, avec la participation de l'ammoniac et de la ninhydrine, forme également une substance colorante appelée "violet de Rueman" (ou "bleu de Rueman"), tandis que d'autres, au contraire, ne supposent que sa participation sans la présence de produits aminés intermédiaires. Il y a aussi quelques points intéressants dans le compte rendu de la réaction elle-même, en particulier, cela concerne les méthodes de fixation du dérivé aminé de la ninhydrine à sa molécule principale pour former un colorant. L'indication de la place de "l'hydrogène marchant" obtenu par l'amine intermédiaire du milieu aqueux reste également discutable: il peut être soit dans le groupe cétone soit à côté de –NH2.
En réalité, la nuance avec l'atome H est insignifiante, car sa position dans le composé ne joue pas de rôle particulier au cours de la réaction, il ne faut donc pas y prêter attention. Quant à l'omission d'une des étapes possibles, la raison réside ici dans l'aspect théorique: jusqu'à présent, le mécanisme exact de formation du pourpre de Rueman n'a pas été déterminé avec précision, de sorte que des schémas assez différents de la réaction à la ninhydrine peuvent être trouvés.
Le déroulement le plus complet possible de l'interaction du réactif avec les composés aminés sera proposé ci-dessous.
Mécanisme de réaction
Premièrement, la ninhydrine interagit avec l'acide α-aminé, le fixant au site de clivage des groupes hydroxy et formant un produit de condensation (Fig. 2a). Ensuite, ce dernier est détruit, libérant l'amine intermédiaire, l'aldéhyde et le dioxyde de carbone (Fig. 2b). Du produit final lors de l'adhésionla ninhydrine, la structure pourpre de Rueman (dicétonhydrindencétohydrinamine, Fig. 2c) est synthétisée. Est également indiquée la formation possible d'hydrindanthine (ninhydrine réduite) à partir de l'amine intermédiaire, qui se transforme également en un composé colorant en présence d'ammoniac (plus précisément d'hydroxyde d'ammonium) avec un excès du réactif lui-même (Fig. 2d).
La formation d'hydrindantine a été prouvée par Rueman lui-même lorsque le sulfure d'hydrogène agit sur la molécule de ninhydrine. Ce composé est capable de se dissoudre dans le carbonate de sodium Na2CO3, colorant la solution en rouge foncé. Et lorsque de l'acide chlorhydrique dilué est ajouté, l'hydrindanthine précipite.
Très probablement, l'amine intermédiaire, l'hydridanthine, la ninhydrine et la structure du colorant, en raison de leur instabilité lorsqu'ils sont chauffés, sont dans un certain équilibre, ce qui permet la présence de plusieurs étapes supplémentaires.
Ce mécanisme convient pour expliquer la réaction de la ninhydrine avec d'autres composés aminés, à l'exception des sous-produits résultant de l'élimination du reste de la structure de –NH2, -NH ou -N.
Test du Biuret et autres réactions aux protéines
L'analyse qualitative des liaisons peptidiques, même des structures non protéiques, peut avoir lieu non seulement avec la participation du réactif ci-dessus. Cependant, dans le cas d'une réaction de la ninhydrine aux protéines, l'interaction ne se produit pas le long des groupes -CO-NH‒, mais le long des groupes amine. Il existe une soi-disant "réaction de biuret", qui se caractérise par l'ajout d'ions à la solution avec des composés aminéscuivre bivalent de CuSO4 ou Cu(OH)2 en milieu alcalin (Fig. 3).
Au cours de l'analyse, en présence des structures nécessaires, la solution vire au bleu foncé en raison de la liaison des liaisons peptidiques en un complexe de couleur, qui distingue un réactif d'un autre. C'est pourquoi les réactions du biuret et de la ninhydrine sont universelles en ce qui concerne les structures protéiques et non protéiques avec le groupe -CO-NH‒.
Lors de la détermination des acides aminés cycliques, une réaction de xantoprotéine avec une solution concentrée d'acide nitrique HNO3 est utilisée, ce qui donne une couleur jaune lorsqu'il est nitré. Une goutte de réactif sur la peau présente également une couleur jaune en réagissant avec les acides aminés des cellules de la peau. L'acide nitrique peut provoquer des brûlures et doit également être manipulé avec des gants.
Exemples d'interaction avec des composés aminés
La réaction à la ninhydrine pour les acides α-aminés donne un bon résultat visuel, à l'exception des structures de couleur proline et hydroxyproline, qui réagissent avec la formation d'une couleur jaune. Une explication possible de cet effet a été trouvée dans d'autres conditions environnementales de l'interaction de la ninhydrine avec ces structures.
Réaction avec le groupe amino
Le test n'étant pas spécifique, la détection visuelle de l'alanine à l'aide de la réaction à la ninhydrine dans le mélange n'est pas possible. Cependant, par chromatographie sur papier, en appliquant des échantillons de divers acides α-aminés, en les pulvérisant avec une solution aqueuse de ninhydrine et en les développant dans un milieu spécial, on peutcalculer la composition quantitative non seulement du composé revendiqué, mais aussi de bien d'autres.
Schématiquement, l'interaction de l'alanine avec la ninhydrine suit le même principe. Il se fixe au réactif au niveau du groupe amine, et sous l'action des ions hydronium actifs (H3O+) est séparé au niveau du carbone -liaison azote, se décomposant en acétaldéhyde (CH3COH) et dioxyde de carbone (CO2). Une autre molécule de ninhydrine se fixe à l'azote, déplaçant les molécules d'eau, et une structure colorante se forme (Fig. 4).
Réaction avec un composé aminé hétérocyclique
La réaction de la ninhydrine avec la proline est spécifique, en particulier dans les analyses chromatographiques, car de telles structures en milieu acide virent d'abord au jaune, puis virent au violet en milieu neutre. Les chercheurs expliquent cela par une caractéristique du réarrangement du cycle dans le composé intermédiaire, qui est précisément affecté par la présence d'un grand nombre de protons d'hydrogène qui complètent le niveau d'énergie externe de l'azote.
La destruction de l'hétérocycle ne se produit pas et une autre molécule de ninhydrine lui est attachée au niveau du 4ème atome de carbone. Lors d'un chauffage supplémentaire, la structure résultante dans un milieu neutre se transforme en violet Rueman (Fig. 5).
Préparation du réactif principal
Le test à la ninhydrine est effectué avec différentes solutions, en fonction de la dissolution des structures aminées dans certains composés organiques etcomposés inorganiques.
Le réactif principal est la préparation d'une solution à 0,2% dans l'eau. Il s'agit d'un mélange polyvalent, car la plupart des composés se dissolvent bien dans H2O. Pour obtenir un réactif fraîchement préparé, un échantillon de 0,2 g de ninhydrine chimiquement pure est dilué dans 100 ml d'eau.
Il convient de noter que pour certaines solutions analysées, cette concentration est insuffisante, de sorte que des solutions à 1 % ou 2 % peuvent être préparées. Ceci est typique pour les extraits de matières premières médicinales, car ils contiennent différentes classes de composés aminés.
Lors de la réalisation d'études chromatographiques, des solutions, par exemple lors du lavage d'un mélange sur un support solide à travers une colonne, peuvent être préparées dans de l'alcool, du diméthylsulfoxyde, de l'acétone et d'autres solvants polaires - tout dépendra du solvant de certains structures aminées.
Demande
La réaction à la ninhydrine permet de détecter de nombreux composés aminés en solution, ce qui en fait l'une des premières à être utilisée dans l'analyse qualitative des substances organiques. La détermination visuelle réduit considérablement le nombre d'expériences, en particulier lors de l'analyse de plantes, de médicaments et de formes posologiques mal étudiés, ainsi que de solutions et de mélanges inconnus.
En médecine légale, cette méthode est largement utilisée pour déterminer la présence de marques de sueur sur n'importe quelle surface.
Même malgré la non-spécificité de la réaction, le retrait de la réaction à la ninhydrine de la pratique chimique est impossible, puisquele remplacement de cette substance par des analogues moins toxiques (par exemple, l'oxoline) a prouvé qu'ils étaient moins sensibles aux groupes aminés et ne donnaient pas de bons résultats dans les analyses photométriques.
