Culture de bactéries : méthodes, principes, étapes et conditions

2024 Auteur: Angel Austin | [email protected]. Dernière modifié: 2023-12-17 05:26

Les micro-organismes présents dans la nature qui nous entoure sont partout: dans les sols, les plans d'eau, à la surface de divers objets, les personnes et les animaux en sont habités. Tout cela peut servir de source de contamination microbienne des aliments, des médicaments et des chaînes de production. La culture des bactéries est nécessaire pour étudier leurs propriétés, leurs besoins et leurs caractéristiques. Ceci, à son tour, est une étape importante dans le développement de divers médicaments, le diagnostic en laboratoire des maladies, le calcul des réacteurs de production et bien plus encore.

Concepts généraux

La culture de bactéries en microbiologie fait référence à la culture de micro-organismes réalisée en laboratoire. À leur tour, les microbes qui se sont développés sur un milieu nutritif sélectionné sont appelés une culture. Les cultures peuvent être mélangées si elles sont formées par différents types de micro-organismes, et pures si elles sont représentées par un seul type de bactéries.

Si nutritionnelUne seule cellule est placée dans le milieu et un groupe d'individus est obtenu à la suite de sa reproduction, cet ensemble de micro-organismes est alors appelé clone. Lorsqu'un clone se développe au point de devenir visible à l'œil nu, cet ensemble de bactéries s'appelle une colonie.

Habituellement, la culture de bactéries isolées à partir de différentes sources est effectuée séparément les unes des autres. Chacun de ces groupes de microbes cultivés séparément est appelé une souche. Ainsi, si un type de staphylocoque est isolé à partir de trois sources (ou différentes portions du même produit, différentes personnes), ils parlent de trois souches de ce type de staphylocoque.

Facteurs de croissance des bactéries

Ceux-ci comprennent divers acides aminés, lipides, bases puriques et autres composés nécessaires au développement des micro-organismes. Certains microbes peuvent produire indépendamment les substances dont ils ont besoin, tandis que d'autres doivent les recevoir sous forme finie. Selon les besoins des microorganismes en certains facteurs de croissance, une identification et une différenciation des bactéries sont réalisées. De plus, ce paramètre est important pour la préparation correcte d'un milieu nutritif pour les travaux de laboratoire et biotechnologiques:

Acides aminés. Les bactéries peuvent avoir besoin d'un acide aminé ou d'un groupe d'acides particulier. Ainsi, les clostridies ont besoin de leucine et de tyrosine, les streptocoques ont besoin de leucine et d'arginine. Les micro-organismes qui ont besoin d'acides aminés de l'extérieur pour se développer sont appelés auxotrophes.
Bases puriques et pyrimidiques, ainsi que leurs dérivés (adénine, guanine et autres). Ils sont un facteur important dans la croissance de nombreuxEspèces de streptocoques.
Vitamines. Ils font partie des coenzymes nécessaires aux bactéries. Ainsi, l'acide nicotinique, ainsi que son amide, qui font partie du NAD et du NADP, sont nécessaires à la diphtérie et aux shigella corynebactéries. La thiamine, en tant que partie intégrante du pyrophosphate, est requise par Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. L'acide pantothénique, qui fait partie de la coenzyme CoA, est requis par le bacille du tétanos et certains types de streptocoques. Les cytochromes, et donc l'acide folique, les hèmes et la biotine qui les composent, sont nécessaires à Mycobacterium tuberculosis et Haemophilus influenzae.

Exigences environnementales

Conditions des milieux de culture pour la culture de bactéries:

Nutrition. Ils doivent contenir des substances, en outre, sous une forme facilement digestible, nécessaires aux micro-organismes pour se nourrir et se reconstituer en énergie. Ceux-ci incluent les organogènes et les minéraux. Certains micro-organismes ont en outre besoin de vitamines et d'acides aminés qu'ils ne peuvent pas synthétiser.
Niveau de pH optimal. Il affecte la perméabilité de la membrane cellulaire et, par conséquent, la capacité d'absorption des nutriments par la bactérie. Le plus souvent, la valeur du pH doit être au niveau de 7, 2–7, 4. De nombreux micro-organismes au cours de leur vie produisent des produits avec des réactions acides ou alcalines, et pour que le pH du milieu nutritif ne change pas, il doit être mis en mémoire tampon.
Isotonique. La pression osmotique dans le milieu nutritif pour la culture des bactéries doit avoir les mêmes valeurs queà l'intérieur des cellules microbiennes. Cela correspond généralement à une solution de NaCl à 0,5 %.
Stérilité. Cela est dû au fait que l'apparition de bactéries étrangères faussera les résultats de l'étude de la souche analysée.
Niveau d'humidité. Cet indicateur, ainsi que la consistance du milieu, doivent avoir des caractéristiques optimales pour un type particulier de bactéries.
Potentiel redox (RH2). Il montre le rapport des substances qui donnent et acceptent des électrons, ainsi que le niveau de saturation en oxygène du milieu nutritif. Pour les aérobies et les anaérobies, les conditions de culture des bactéries diffèrent quelque peu dans cet indicateur. Les micro-organismes anaérobies se reproduisent mieux à des valeurs RH2 inférieures à 5 et les micro-organismes aérobies au moins à 10.
Uniformité. Il est important que le milieu de culture contienne des quantités constantes de ses ingrédients individuels. De plus, les solutions claires sont préférées, ce qui facilite la surveillance de la croissance des cultures ou la détection de contamination.

Types de milieux de culture

Le choix d'un milieu particulier pour la culture de micro-organismes est influencé par de nombreux facteurs, parmi lesquels les caractéristiques de leur nutrition et le but de l'étude. Les principales caractéristiques sous-jacentes à la classification des milieux nutritifs sont:

1. Composants. Selon les substances initiales utilisées pour créer le substrat, ils distinguent:

natural, qui sont préparés à partir de produits d'origine animale ou végétale (par exemple, viande, lait, fruits) et conviennent à la culture mixtecultures;
semi-synthétique, dans laquelle les produits alimentaires naturels coûteux sont remplacés par des produits non alimentaires (par exemple, farine d'os, caillots sanguins), et qui sont optimaux pour cultiver certains types de bactéries ou isoler leurs produits métaboliques de la environnement;
synthétiques, qui sont préparés à partir de quantités précises de composés chimiques, ont une composition constante connue et sont facilement reproductibles.

2. Cohérence (densité). Distinguer les environnements:

liquide;
dense;
semi-liquide.

Les deux derniers sont préparés à partir de solutions spéciales ou de substances liquides additionnées d'agar-agar ou de gélatine pour créer la densité requise. De plus, un environnement dense pour la croissance des bactéries est le sérum sanguin coagulé, les pommes de terre, le gel de silice, le carraghénane.

3. Composé. Sur cette base, les environnements sont:

simple, dont la liste est courte est le bouillon de peptone de viande (MBB), le bouillon et la gélose Hottinger, la gélose de peptone de viande (MPA), la gélatine nutritive et l'eau peptonée.
complexe, préparé à partir de simples avec l'ajout de sang, de lactosérum, de glucides et d'autres substances.

4. Rendez-vous. On distingue les milieux nutritifs suivants:

main sont utilisés pour cultiver de nombreux microbes pathogènes (composition généralement simple);
ceux spéciaux sont utilisés pour isoler et cultiver des bactéries qui ne poussent pas sur des substrats simples;
selective (ils sont également sélectifs) sont adaptés pour isoler un type spécifique de bactéries et inhiber la croissance des microbes associés (sélectivitécréé en ajoutant certaines substances au milieu, telles que des antibiotiques ou des sels, ou en ajustant le pH);
le diagnostic différentiel permet de distinguer un type de bactérie d'un autre en évaluant par exemple l'activité enzymatique du milieu;
des conservateurs sont nécessaires pour l'inoculation initiale avec le transport ultérieur des échantillons, car ils empêchent la mort des micro-organismes et inhibent la croissance d'autres bactéries.

Préparation des médias

L'étape la plus importante dans la culture des bactéries anaérobies est la préparation d'un milieu nutritif approprié. Une fois les paramètres optimaux sélectionnés, passez aux étapes suivantes:

pesée, en sélectionnant un échantillon de composants sur une balance analytique;
dissolution effectuée dans de l'eau distillée chauffée à 70 °C, et les phosphates, micro- et macrosels sont dissous séparément;
faire bouillir dans un bain-marie pendant deux minutes;
Détermination du pH par papier indicateur ou potentiomètre;
filtration à travers un tissu humide ou des filtres en papier pour les milieux denses liquides et fondus, et à travers un filtre en gaze de coton pour les milieux gélosés;
embouteillage effectué au 3/4 de la capacité;
stérilisation dépendante du milieu;
le contrôle de la stérilité s'effectue par décantation pendant deux jours dans un thermostat, suivi d'un visionnage;
contrôle chimique pour établir le pH et le contenu du nécessairearticles;
contrôle biologique par inoculation d'essai.

Stérilisation de la verrerie et des médias

L'un des principes de base de la culture bactérienne est la stérilité. La croissance et le développement de micro-organismes étrangers peuvent affecter les caractéristiques du milieu nutritif en modifiant sa composition chimique et son pH. La stérilisation est la principale condition pour la culture de cultures pures. En pratique, ce terme désigne les méthodes de destruction d'absolument toutes les formes de vie à la surface et dans le volume des objets stérilisés. Les vaisseaux, les instruments utilisés, les médias et les autres objets utilisés pendant l'étude sont stérilisés.

Quelques types de stérilisation:

Allumage. Stérilisation des anses et des aiguilles pour l'ensemencement, des lames de verre, certains instruments peuvent être réalisés à l'aide d'un brûleur ou d'une lampe à alcool.
Ébullition. Convient pour la manipulation de seringues, d'aiguilles, de nourriture, mais ne tue pas les spores bactériennes.
Stérilisation à la chaleur sèche. Il est réalisé dans une armoire de séchage spéciale et convient au traitement des flacons, éprouvettes et autres verreries de laboratoire.
Stérilisation à la vapeur. Réalisée en autoclave, cette méthode est très efficace. Mais il ne convient pas aux milieux nutritifs contenant des protéines ou tout autre composé qui se décompose à des températures élevées. Plus épargnant peut être appelé tyndalisation. Elle est réalisée dans la chaudière de Koch et combine la germination des spores avec leur destruction.
Pasteurisation. Il est utilisé pour les fluides qui changent de propriétés lorsqu'ils sont bouillis (par exemple, le lait, le vin, la bière), capables deles débarrasser des micro-organismes non porteurs de spores. La température de traitement n'est que de 50 à 60 ° C pendant quinze à trente minutes. Dans certains cas, une stérilisation à froid est utilisée, réalisée à l'aide de filtres ou de rayons UV.

Conditions de culture des bactéries

La croissance et le développement des bactéries ne sont possibles que sous certains facteurs et les valeurs de chacun d'eux:

1. Température. Il existe trois groupes de bactéries qui diffèrent par leurs préférences de température:

les thermophiles, ou microbes qui aiment la chaleur, se développent à 45-90°C, ce qui signifie qu'ils ne se multiplient pas dans les organismes humains et animaux;
les psychrophiles, ou micro-organismes qui aiment le froid, préfèrent des températures comprises entre 5 et 15 °C et sont cultivés dans des entrepôts frigorifiques;
mésophiles, se développent à une température de 25-37°C, ils comprennent l'essentiel des bactéries.

2. Léger. C'est une caractéristique de la culture des bactéries phototrophes, car elles réalisent le processus de photosynthèse. Mais pour la plupart des microbes, l'éclairage n'est pas une condition préalable. Et même vice versa, les ultraviolets solaires peuvent supprimer leur développement.

3. Eau. Tous les micro-organismes ont besoin d'eau sous une forme accessible (liquide). C'est pourquoi les aliments surgelés ont peu ou pas de croissance bactérienne.

4. Acidité du milieu. Ce principe de culture des bactéries a déjà été discuté en détail ci-dessus.

5. Aération. L'oxygène, en tant qu'élément chimique, fait partie intégrante de l'eau et d'un nombre considérable de composés utilisés pourculture de micro-organismes. L'oxygène gazeux peut également être contenu dans l'eau et d'autres liquides sous forme dissoute. Une partie importante des bactéries a besoin d'un apport constant de molécules d'oxygène. Mais pour un certain nombre de micro-organismes, cela n'est pas nécessaire ou, pire, l'oxygène gazeux est toxique pour eux, car ils ne possèdent ni catalase ni peroxydase, qui détruisent les produits respiratoires toxiques. Par conséquent, l'étape la plus importante dans la culture des bactéries anaérobies est l'élimination des molécules O₂ du milieu nutritif.

6. Culture de micro-organismes. La culture de bactéries aérobies et anaérobies est réalisée dans différentes couches de l'environnement et selon différents modes.

Culture de micro-organismes aérobies

La culture de bactéries aérobies nécessite de l'oxygène moléculaire. Pour obtenir des cultures pures d'aérobies utilisables avec succès en médecine et dans l'industrie alimentaire, les méthodes suivantes sont utilisées:

surface se développant sur des milieux denses ou dans des milieux liquides (leur fine couche) lorsque l'oxygène provient directement de l'air;
culture en profondeur dans des milieux liquides, lorsqu'une augmentation de la quantité d'oxygène dissous dans ceux-ci est obtenue par une aération constante.

Culture de micro-organismes anaérobies

Le principe de base de la culture de bactéries de ce type est leur contact minimal avec l'oxygène atmosphérique. Assurer les conditions de leur croissance est beaucoup plus difficile que pour les aérobies. Les méthodes suivantes sont utilisées pour isoler les anaérobies de l'O moléculaire₂:

Physique. Cette méthode de culture de bactéries anaérobies est réduite à leur culture dans un appareil à vide spécial - un microanaérostat. L'air qu'il contient est remplacé par un mélange gazeux spécial d'azote additionné de 10 % d'hydrogène et de 5 % de dioxyde de carbone.
Chimique. Ceux-ci comprennent: l'utilisation d'agents absorbants (par exemple, Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) ou des agents réducteurs (tels que l'acide ascorbique).
Biologique. Cela se résume à la co-culture d'aérobies et d'anaérobies dans un système fermé. Cette méthode de culture des bactéries consiste à ensemencer une moitié d'une boîte de Pétri avec certaines des espèces de bactéries aérobies et l'autre moitié avec l'anaérobie étudié. Son développement commencera au moment où tout l'oxygène sera épuisé.

Les méthodes d'ensemencement suivantes conviennent à la culture de bactéries anaérobies:

dans la couche de surface;
dans la couche superficielle remplie de paraffine stérile;
dans l'épaisseur d'un milieu nutritif dense;
dans des couches profondes de milieux visqueux.

Obtenir une culture pure

Les microbiologistes travaillent généralement avec des échantillons habités par de nombreux types de microbes différents. Cependant, pour déterminer la position systématique des micro-organismes (famille, genre, espèce), ainsi que pour étudier leurs caractéristiques, il est nécessaire de les isoler et de faire pousser une culture pure. Ils sont d'une grande importance dans de nombreuses industries alimentaires, par exemple, le fromage, le pain, le kvas, le vin, etc. La culture de bactéries lactiques permet d'obtenirun composant essentiel pour la production de produits laitiers fermentés, de pâte, de cacao, d'ensilage et même de plastique.

La méthode d'isolement d'une culture pure dans un milieu dense est basée sur la séparation mécanique des cellules de micro-organismes avec leur culture isolée ultérieure. L'échantillon est transféré dans un volume stérile d'eau ou de solution saline (volume 10-100 ml) puis agité pendant deux minutes. Afin d'extraire les micro-organismes situés dans l'épaisseur du matériau à l'étude (par exemple, des saucisses ou du fromage), on frotte d'abord les échantillons avec des instruments stériles avec du sable. Le matériel ayant subi une préparation préalable, pesant 1 g ou un volume de 1 ml, est dilué avec de l'eau stérile 10, 100, 1000, etc. fois. On choisit le degré de dilution qui donne une concentration de cellules correspondant aux capacités de la méthode.

La culture ultérieure de micro-organismes consiste à préparer un milieu nutritif. Habituellement, un milieu dense (MPA) est choisi. Il est d'abord fondu et refroidi à 45-50 ° C, puis versé dans plusieurs boîtes de Pétri (trois à cinq pièces), au fond desquelles sont placés des écouvillons de la substance d'essai de différentes concentrations. Ensuite, le mélange du milieu nutritif encore non congelé et de la matière introduite dans celui-ci est effectué. C'est ainsi que les cellules se fixent en différents points du volume du substrat.

Ensuite, les boîtes de Petri sont placées dans un thermostat pendant 2 jours à 22 °C. Pendant ce temps, les cellules se multiplient à tel point que la colonie formée par chacune des cellules devient visible à l'œil nu. Chacun d'eux est une culture pure du type de bactérie dont les cellulesrose.

Après cela, à partir de boîtes de Pétri, les micro-organismes sont sous-cultivés dans des tubes à essai séparés remplis d'un milieu nutritif. De cette manière, des cultures pures sont isolées d'un échantillon mixte. Cette méthode porte le nom de son développeur - R. Koch. On l'appelle aussi communément la méthode de la coupelle, ou semis à épuisement. Après avoir obtenu des cultures pures de différents types de bactéries, leur forme, leurs spores et leurs familles sont déterminées.

Tous les travaux doivent être effectués selon les principes de l'asepsie. Pour éviter le développement prématuré de micro-organismes, l'étude doit être effectuée immédiatement après le prélèvement. L'eau du robinet est analysée après avoir vidé les premières portions, car elles peuvent contenir des microbes accumulés dans les tuyaux et les robinets. La microflore des fruits, des baies et des légumes est principalement située à la surface (pelure), par conséquent, des lavages sont effectués à partir de celle-ci. Pour ce faire, placez le fœtus dans un récipient stérile et remplissez-le avec la quantité d'eau requise. Ensuite, ils sont secoués assez vigoureusement et l'eau est versée dans un autre récipient. Les récoltes de produits en tissu sont également obtenues dans des écouvillons, mais au préalable, des morceaux d'une taille donnée en sont découpés.